Contra – Prova
A contra-prova consiste em fazer uma reação de multiplex com uma amostra de DNA e pelo menos mais uma reação com a segunda amostra biológica do paciente envolvido, confirmando o resultado obtido (inclusão ou exclusão).
As duas amostras de DNA são processadas por técnicos diferentes em momentos diferentes. O uso da contra-prova em todos os casos e dos “marcadores de segurança” nas reações tornam os testes realizados na BIOCOD totalmente seguros contra erros humanos.
Marcadores de DNA
Herança genética é o resultado da combinação do conjunto de genes herdados da mãe e do pai no momento da concepção. O conjunto de genes – genótipo – de cada indivíduo se organiza de maneira a formar um padrão único que definirá a sua individualidade genética por toda a sua vida.
Os genes são constituídos de DNA que, por sua vez, é constituído da seqüência de 4 compostos químicos denominados Adenina (A), Citosina (C), Guanina (G) e Timina (T). Estas moléculas, conhecidas como bases, alinhadas uma após outra, geram as instruções genéticas de cada indivíduo. As variações nas seqüências de bases do DNA refletem a variabilidade genética individual e, em última análise, de uma população.
Entretanto, para que se identifique um indivíduo, sua ascendência ou descendência utilizando seu material genético, não se faz necessária a análise de todo o seu DNA. Pode-se, para isso, estudar um grande número de regiões do seu genótipo denominadas microssatélites. Os microssatélites, também conhecidos como marcadores de DNA, são grupos de pequenas seqüências de bases que se repetem inúmeras vezes e aparecem entremeando os genes em várias regiões do genoma. Estes marcadores não são genes e não possuem uma função conhecida no genoma, mas são herdados como os genes: 50% vindos da mãe e 50% vindos do pai. Desta maneira, para cada marcador o indivíduo possui 2 alelos, um materno e outro paterno. A combinação dessas características faz com que os marcadores sejam excelentes ferramentas no estudo da paternidade e na definição da identidade individual.
A Biocod desenvolveu conjuntos de reações que permitem a análise simultânea de vários desses marcadores (multiplex). O resultado da análise do DNA de cada indivíduo fornece um perfil genético único (exceto para gêmeos univitelinos) que identifica este indivíduo e pode ser utilizado para estudos de paternidade ou maternidade. A moderna tecnologia empregada, aliada à grande experiência de seus especialistas, permite que a Biocod ofereça exames com alto nível de confiabilidade, a um custo acessível e a curto prazo.
Marcadores de Segurança
A nossa proposta de trabalho para um resultado seguro na realização de testes de paternidade inclui o uso de ?marcadores de segurança? em todas as reações de PCR em multiplex.
Essa metodologia consiste na análise de um mesmo marcador em diferentes reações multiplex. Como o laboratório utiliza mais de um multiplex em sua rotina e estas reações são feitas separadamente, o fato de um microssatélite se repetir em mais de um multiplex nos permite efetuar a comparação do perfil de um mesmo paciente em reações diferentes, impossibilitando, assim, uma eventual troca devido a erros humanos.
PCR
PCR (reação em cadeia da polimerase) é uma metodologia que permite a multiplicação (ou amplificação) de seqüências específicas de DNA em equipamentos conhecidos como termocicladores.
As amplificações são realizadas utilizando-se a enzima TAQ polimerase e iniciadores que delimitam as regiões que serão multiplicadas. As reações se repetem inúmeras vezes em ciclos determinados por diferentes temperaturas, produzindo um grande número de cópias das regiões escolhidas, as quais serão posteriormente analisadas. Nos estudos realizados na Biocod, amplificamos pela PCR regiões do DNA que são denominadas microssatélites ou marcadores de DNA.
A mistura de reação contém as seqüências de DNA que serão amplificadas, os iniciadores (I1 e I2) e a enzima DNA polimerase.
Inicialmente a mistura de reação é aquecida a 95ºC para desnaturar o DNA, processo esse denominado desnaturação.
Após isso esta mistura é resfriada a 50ºC, o que permite a ligação dos iniciadores, que delimitam as seqüências que serão amplificadas. Essa parte da reação recebe o nome de anelamento.
Por fim, a mistura é novamente aquecida, desta vez a 72ºC, para que a DNA polimerase sintetize as novas seqüências complementares. Esta etapa é denominada extensão.
